前言：

钠通道是一种在神经细胞和肌肉细胞中起关键作用的离子通道，它负责调控细胞膜的电位变化和神经传递过程中的动作电位产生

，我们发现L993F突变使非洲爪蟾卵母细胞中钠通道对拟除虫菊酯溴氰菊酯的敏感性降低了五倍，相比之下，E434K和C764R都没有单独降低对溴氰菊酯的通道敏感性。

E434K 或 C764R 与 L993F 相结合，将溴氰菊酯的敏感性降低了 100 倍，此外，同时存在所有三种突变（KRF）使通道对溴氰菊酯的敏感性降低了500倍，没有一个突变显着影响通道门控。

全长副 cDNA 和黑腹果蝇尖端 cDNA 的聚合酶链反应 （PCR） 扩增和克隆

蟑螂钠通道基因位编码区的核苷酸序列是通过先前使用测序重叠的cDNA克隆确定的，在研究中，分离了来自成年雄性蟑螂头部和胸部的CSMA菌株的mRNA，并且该菌株对拟除虫菊酯和DDT敏感。

为了放大cDNA，使用与3'非翻译区（5'-AAGAATGAGGCATCTCCGAG-3'）序列相对应的引物合成了第一链cDNA，用eLONGase酶混合物通过PCR扩增了整个编码区域（约6 kb）的片段，

PCR扩增反应混合物（50μl）包括0.5μl cDNA，0.2μmol 5'，具有斜体的Kozak序列），以及提供的1×PCR反应缓冲液

。

便于克隆，KpnI和BamH1限制性位点序列分别添加到5'和3'引物中，5'引物的序列设计符合Kozak序列，以实现高效翻译，将T+4到G+4的改变导致Ser到Ala的替换。

PCR扩增在30°C下进行30个循环，每个循环包括94秒的变性、58秒的退火、68秒的延伸，然后在68°C下进行10分钟的最终延伸，将扩增的全长cDNA克隆连接到带有KpnI和BamH3位点的pGH19中的1'和5'末端。

对克隆KD1的整个插入片段进行了测序，

根据已发表的序列，使用PCR引物扩增了黑腹果蝇尖端cDNA，并将其克隆到pBluescript KS中

。

定点诱变

为了构建一系列突变体构建体，对KD1进行了诱变，其中包括三个突变体E434K，C764R和L993F的不同组合，具体而言，从KD2中剪切出包含所有三个要突变的核苷酸的3.1 kb NdeI片段，并将其克隆到pAlter 1中进行定点诱变。

使用改变位点II体外诱变系统（Promega Corp.）引入点突变，并通过DNA测序确认，然后，从pAlter1中剪切出突变的NdeI片段，并将其克隆回包含KD19序列其余部分的pGH1中，

以生成相应的突变体构建体

。

段落的表达中药材协会非洲爪蟾卵母细胞中的钠通道

卵母细胞是通过手术从阳性雌性非洲爪蟾（Nasco，Ft. Atkinson）的卵巢中获取的，卵母细胞在加利福尼亚州的孵育基质中与1 mg/ml IA型胶原酶一起处理，孵育基质为不含ND 96培养基，含有96 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgCl2和5 mM HEPES，pH 7.5。

使用镊子去除卵母细胞表面残留的卵泡细胞，分离的卵母细胞在含有96.1 mM CaCl的ND-8培养基中进行孵育，

该培养基补充了50 μg/ml 庆大霉素、5 mM 丙酮酸和0.5 mM 茶碱，仅选择健康的V-VI期卵母细胞用于cRNA注射

。

为了制备用于注射的卵母细胞cRNA，线性化para或tipE构建体的质粒DNA，使用不切割插入片段的NotI限制性酶切，然后用mMESSAGE mMACHINE试剂盒（Ambion）和T7聚合酶进行体外转录。

将帕拉中药材协会的cRNA（1ng）和tipE cRNA（1ng）一同注射到卵母细胞中，然后在19°C下孵育10天。

电生理记录和分析

电生理记录和数据分析的方法与之前描述的方法相似，使用标准的双电极电压钳记录钠电流，硼硅酸盐玻璃电极填充了滤波后的3 M KCl，电阻小于0.5 MΩ，用卵母细胞钳夹仪OC725C、Digidata 1200A接口和pCLAMP 6软件来测量电流。

所有实验都在室温（20-22°C）下进行，为了校正容性瞬态和线性泄漏电流，使用P/N减法技术或者通过减去在存在20 nM河豚毒素（TTX）下得到的记录来进行校正，这样可以完全阻断帕拉钠通道。

在溴氰菊酯的应用中，采用了一次性的灌注系统，简单来说，

将测试溶液转移至放置在支架上的培养皿中，使用两个玻璃毛细管（长度为10厘米）与短长度的Tygan管连接在一起

，以帮助溶液从培养皿流向记录室。

溶液的流量由通过调节培养皿相对于记录室的水平来控制静水力产生，使用一次性记录室（容积为1-1.5毫升），并在载玻片上制作胶坝，由于溴氰菊酯具有极强的亲脂性，在一次使用后将记录室、灌注系统以及连接卵母细胞室和接地电极室的玻璃琼脂糖桥丢弃。

溴氰菊酯的储备溶液（浓度为100 mM）是在二甲基亚砜（DMSO）中制备的，在使用前，立即将工作溶液制备在ND-96介质中，溴氰菊酯对钠通道尾流的影响在灌注后的5分钟内达到稳态水平。

电压依赖性钠通道电导（G）的计算方法如下：通过以120 mV的增量测量从-60至+5 mV的测试电位处的峰值电流，并除以（V-V转速）来计算，其中V是测试电位，V转速是钠的逆转潜力。

反转电位由I-V曲线确定，峰值电导值可以通过双态玻尔兹曼方程拟合1/2)/k的形式为G=1 - [1+exp(V-V1/2)/k]的计算得出，其中V是电压脉冲的电位，V1/2是激活的半最大电压，k是斜率因子。

钠通道失活的电压依赖性计算方法如下：通过以200 ms的保持电位从-120至+40 mV的预脉冲以5 mV的增量确定，然后测试脉冲至-5 mV，持续12 ms，将测试期间的峰值电流幅度归一化为最大电流幅度，并绘制为预脉冲电位的函数。

数据可以通过双态玻尔兹曼方程拟合为I=I.max*[1+(exp(V-V1/2)/k)]-1的形式，

其中I.max是诱发的最大电流，V是电压脉冲的电位，V1/2是50%电流失活时的电压（失活曲线的中点），k是斜率因子

。

使用溴氰菊酯修饰的通道百分比计算方法如下：通过公式M=[I尾巴/(Eh-E那)]/[I那/(Et-E那)]×100计算，其中I尾巴是最大尾电流幅度，Eh是膜复极化的电位，E那是由I-V曲线确定的钠电流的反转电位，I那是溴氰菊酯暴露前去极化过程中峰值电流的幅度，Et是阶跃去极化的潜力。

浓度-响应数据可以拟合到希尔方程：M=M.max/1+（K50/[溴氰菊酯])^n，

其中[溴氰菊酯]和EC50分别表示溴氰菊酯的浓度和产生半最大效应的浓度，n表示希尔系数，M.max是钠通道修饰的最大百分比

。

Para 的功能表达中药材协会在非洲爪蟾卵母细胞中

我们通过RT-PCR从一只全长蟑螂中分离出了cDNA克隆KD1，在KD502和先前发表的序列之间发现了四个氨基酸序列差异，分别是R1285G，L1685P，V1806A和I1L，KD1包含替代外显子1，但不包含替代外显子2和另一个替代外显子。

在爪蟾卵母细胞中表达的结果证实了KD1编码功能性钠通道蛋白，具体来说，

在与para共同注射的大多数卵母细胞中的第2天或第5天检测到峰值电流约为4-5μA的钠电流，提示cRNA（每个1 ng）用于注射

。

使用10 nM TTX阻断的钠电流示例迹线显示在图中，为了测试电压依赖性，将卵母细胞钳夹在-120mV的保持电位下，并以80mV的增量进行去极化测试，范围从-60至5mV之间，蟑螂帕拉中药材协会的钠电流在大约-40 mV时被检测到通道，并在-10 mV时达到峰值。

根据第2节的描述，计算平均相对钠电导率，并将其绘制为去极化测试电位，钠通道的半最大值激活电压为-29.0±1.3 mV，斜率因子为5.5±0.5，为了确定稳态失活的电压依赖性，将卵母细胞保持在-120 mV，并通过一系列的200 ms灭活。

预脉冲以5 mV的增量从-120至+40 mV去极化，然后以12 ms的测试脉冲至-5mV以测量通道的可用性，稳态失活的电压依赖性通过绘制归一化峰值电流作为预脉冲电位的函数来获得，根据第2节的描述，

稳态失活的半最大值电压为-42.4±0.4 mV，斜率因子为5.0±0.1

。

kdr型突变对通道表达和门控特性的影响

五段突变（D58G，E434K，C764R，L993F和P1880L）与蟑螂的kdr型抗性相关，在最近收集的993个拟除虫菊酯抗性群体中，发现1997个中有L1998F突变，发现E993K和C2000R突变只在五个高度抗拟除虫菊酯的群体中与L58F突变共存。

而D2000G和P993L突变仅在其中一个群体中发现，我们假设L764F突变导致蟑螂出现低水平的敲低抗性，而其他四个突变则导致高水平的kdr型抗性，为了验证这一假设，生成了三种最常见的突变，即E993K。

这些突变体用单字母代码表示存在的新氨基酸，如果有多个突变，则用多个字母表示

，检查了各种突变组合对卵母细胞中钠通道峰值电流的影响，突变通道（帕拉CSMA-F，段CSMA-KR，段CSMA-RF，段中联-钦哲基金会和帕拉CSMA-KRF）所有表达的钠电流的峰值电流与野生型通道的峰值电流进行了比较，证明突变通道的门控特性显然是正常的。

kdr型突变改变了帕拉中药材协会通道对溴氰菊酯的敏感性

拟除虫菊酯通过减缓失活和失活来改变钠通道的功能，具体来说，钠电流在去极化过程中持续时间延长，与复极化相关的尾电流明显增加，这种拟除虫菊酯诱导的尾电流已被用于评估钠通道的拟除虫菊酯修饰效果。

比较了两种尾电流记录方案，一种是采用从-500到100 mV的0 ms去极化脉冲序列，另一种是采用从-100到5 mV的100 ms去极化脉冲序列，发现采用第二种脉冲序列时观察到更显著的尾电流，

表明溴氰菊酯与通道的开放状态有相互作用

。

因此，为了测量拟除虫菊酯诱导的尾电流，采用了每次去极化间隔为2 ms、从-100到5 mV的120 ms去极化脉冲序列的记录方案，记录方案施加每种溴氰菊酯浓度后5分钟开始，以获得尾电流的痕迹，溴氰菊酯诱导的尾电流最初增加，然后逐渐减小，形成钩状尾电流。

结论：

研究表明，在哺乳动物神经元和卵母细胞中表达的钠通道中观察到了溴氰菊酯诱导的钩尾电流，尾电流的初始增加阶段是去极化终止时灭活门延迟关闭的结果，尾电流的后续衰减反映了修改后的通道失活的缓慢速率。

突变组合RF，KF和KRF不仅降低了通道对溴氰菊酯的敏感性，还可能通过增加修饰通道的失活速率导致尾电流更完全衰减，先前观察到家蝇kdr和超级kdr突变以及Heliothis virescens L1029H突变的尾流衰减加速，

蟑螂 L993F 突变降低了通道对溴氰菊酯的敏感性，而不会加速尾流的衰减

。

参考文献：

【1】布朗，《拟除虫菊酯杀虫剂和滴滴涕修饰生物碱依赖性钠通道活化及其通过海葵毒素增强》

【2】高普，《拟除虫菊酯杀虫剂：与[3H]-蝄毒素A-20-a-苯甲酸酯与哺乳动物电压敏感钠通道的结合位点》

【3】奥尔森，《帕拉钠通道蛋白中的单个氨基酸变化与德国蟑螂对拟除虫菊酯杀虫剂的敲低抗性 （kdr） 有关》

【4】瓦莱斯，《拟除虫菊酯与培养中哺乳动物神经元细胞中Na通道的相互作用》

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